کاربردهای کلینیکی موجود و افق پزشکی شخصی

توالی‌یابی اولیه ژنوم انسان در حدود ده سال برای تکمیل شدن طول کشید. امروزه با استفاده از توالی یابی نسل جدید (NGS) می توان توالی یابی کل ژنوم (WGS) را در طی چند ساعت انجام داد. پیش از اختراع روش NGS تست های ژنتیکی با توالی یابی سانگر انجام می‌شد. در حوزه پزشکی مرتبط با بیمار های قلبی و عروقی، این فرآیند به طور معمول با توالی یابی ژن یا ناحیه ژنی مورد نظر از یک بیمار انجام داده می شود. در ادامه با  توالی مرجع مقایسه ها صورت گرفته و تفاوت های توالی مرجع و ژن مورد نظر مشخص می گردد. بعد از مشخص شدن تفاوت های ژنی با توالی های آسیب رسان (پاتوژن) مقایسه می شود. به طور کلی این استراتژی در بسیاری از بیماری ها استفاده می شود و ژن های مربوط به یماری زایی مشخص می گردد که بسته به شوه انجام کار محدودیت های خاصی دارد.

NGS بر پایه اصولی است که در آن میلیون ها مولکول DNA همزمان توالی یابی می شوند. این تکنولوژی مرکب این اجازه را می دهد که میلیون ها ملکول DNA کوچک توسط دستگاه های پیشرفته خوانش شوند. تطابق (alignment) و جورچین کردن (assembling) این قطعات کوچک تعیین توالی شده با توالی رفرنس باعث کشف واریانت‌های متفاوت ژنتیکی به طور همزمان  و در تعداد زیاد را می دهد. هرروزه سرعت توالی یابی افزایش و هزینه تمام شده برای هر آزمایش به شدت رقابتی و در حال کاهش است. بنابراین تکنولوزی NGS می تواند در پانل های ژنتیکی، بررسی تک ژنی و حتی WGS به کار گرفته شود. جهش در تکنولوژی های توالی یابی تنها در طی پانزده سال اتفاق افتاده است و کد‌های ژنتیکی را در صدر تکنیکهای تشخیصی و درمانی قرار داده است که بایتسی پزشکان از کارایی و محدودیت های آن مطلع باشند.

 

NGS در پزشکی بیماری های قلب و عروق

در پزشکی قلب و عروق تکنولوژی NGS به عنوان یک راه تشخیصی برای بیماری های مندلی (توارث تک ژنی) به کار می رود. بیماری های مندلی شامل طیف گسترده‌ای از سندرم‌ها می‌شود مانند: سندرم کیوتی بلند (long QT syndrome)، هایپرکلسترومی خانوادگی، کاردیومیوپاتی خانوادگی هایپرتروفیک (HCM)، کاردیومیوپاتی کسترش یافته خانوادگی (DCM) و سندرم مارفان می باشد. حاصل تست های ژنتیکی بر پایه پلت فورم های NGS برای پیدا کردن یک واریانت موثر در ایجاد بیماری در بیماران سندرم کیوسی در حدود 60 تا 80 درصد بوده و بیماران که مبتلا به کاردیو میوپاتی گسترش یافته هستند در حدود 20 تا 40 درصد را به خود اختصاص می دهند. مشخص شدن دلیل ژنتیکی برای این گونه موارد باعث ایجاد آرامش در بیمار شده و باعث غربالگری ها در فامیل و بارداری های آینده می شود. در بیشتر موارد می توان درباره راه کارهای درمانی راهنمایی‌ها لازم را انجام داد. بطور مثال پیدا کردن دلیل ژنتیکی در سندرم کیوتی بلند این اجازه را می‌دهد که درمان های هدفمند برای انواع بیمارهایی که در اثر عملکرد کانال های سدیم و پتاسیم به وجود می آید را انجام داد. علاوه بر آن مشخص کردن دلیل ژنتیکی هایپرتروفی بطنی سمت چپ (می تواند در اثر واریانت در ترانسیرتین یا بیماری فابریس به وجود آمده آید) می تواند درمان های هدفمند که شامل خاموش کردن RNAها، ایزوفورم های تثبیت کننده و یا جایگزینی آنزیمی می باشد را برای بیمار امکان پذیر کند. چندین تست ژنتیکی تجاری برای بیماری های خاص وجود دارد که در آنها ژن های متفاوتی در آن ها مورد ارزیابی قرار می گیرد و به صورت تشخیصی گزارش داده می شود. در مواردی که این پانل ها جواب مشخسی برای بیماری ندارد، استراتژی های توالی یابی وسیع تر مانند توالی یابی تمامی اگزوم یا کل ژنوم می توند مفید باشد. در مواردی که پانل های ژنتیکی جواب واضح ندارند توالی یابی تمامی کل اگزوم (WES) یا WGS می تواند اطلاعات مفیدی درباره واریانت هایی که پتانسیل پاتوژن بودن را دارند را در اختیار ما قرار می دهد که NGS یک تکنولوژی بسیار پیشرفته ای میباشد که این توانایی را در اختیار ما قرار داده است. به خصوص این تکنولوژی با توالی یابی گسترده (throughput) باعث پیدا کردن پاتوژن های می شود که در گزارشات قلبی نیامده، به طوری که در اعضای یک خانواده مشهود است. همچنین استفاده NGS برای این اهداف می تواند جایگاه دقیق ژنی برای واریانت های پاتوژن مشخص کند. این یافته ها در بیمارانی که سابقه فامیلی روشن و دارای افراد زنده در خانواده خود هستند ارزشمند بوده  زیرا آنالیز های تفکیکی برای واریانت های کاندید شده می تواند اجرا شود و نقش آنها مشخص گردد. اگر واریانت ها با تمامی افرادی که آن را حمل می کنند ایجاد بیماری کند این واریانت ژنی قطعا پاتوژن شناخته می‌شود. اما اگر هر کدام از افراد بیمار واریانت پاتوژن فرض شده را حمل نکنند به احتمال زیاد این توالی خاص برای ایجاد یک سندروم پاتوژن نمی باشد. چندین گزارش کلینیکی تلفیق شده با اطلاعات ژنتیکی اشاره به این نکته دارند که WGS و WES  موجب شده در حدود 25 درصد از بیمارانی که بیماری آنها قابل تشخیص نبوده است به نتیجه برسد. همچنین به وجود آمدن تشخیص های سریع ژنتیکی بیماری های ارثی و موزایسم ها منجر به پیشرفت های مثبتی در زمینه مراقبت از بیماران شده است.

 

چالش های NGS در بعد کلینیکی

سرعت و مقرون به صرفه بودن تکنیک NGS با چالش های شناخت مناسب ناحیه ژنومی و پیدا کردن یک واریانت خاص برای بیماری برابری می کند. شیوه های ثبت و ضبط توالی یابی از ناحیه ژنومی انتخاب شده و محیط توالی یابی منجر به پوشش ناکامل در توالی یابی توسط NGS شده است. . برای مثال ناحیه از ژنوم که دارای تعداد بالای باز‌های گوانین و سیتوزین هستند برای انجام عمل رونویسی به دلیل داشتن اتصالات قوی میان دو نوکلئیک اسید، به مشکل بر می خورند. به علاوه خوانش های کوتاه به درستی نمی تواند در نواحی تکراری اطلاعات دقیقی درباره ساختار ژن ها بدهند. برای مثال در دیستروفی میتونیک مرتبط با کاردیومیوپاتی به هم خوردگی ژن های در اثر تعداد زیاد تکرار ها درناحیه خاص از ژنوم ایجاد می شود. به دلیل اینکه اندازه خوانش‌ها در این گونه ژنها از طول تکرارها کوتاه تر است به درستی نمی توان میزان تکرار ها را بدست آورد. در اخر الگوریتم های که برای پیدا کردن یک فرم خاص از واریانت ها مانند حذف و اضافه های کوچک، استفاده می شود به اندازه کافی بهینه نشده است. به طور کلی در حدود 20 تا 25 درصد توالی های اگزونی که که در ایجاد یماری نقش دارند، با پوشش کم NGS و لی بادقت بالا قابل انجام است.

یکی از پیامد های اجنتناب ناپذیر توالی یابی گسترده (WGSیا WES) چالش هایی است که در مشخص کردن پاتوژن بودن واریانت های پیدا شده است. انسان ها در میلیون ها جایگاه ژنی با هم تفاوت دارند که تعداد محدودی از آنها پیدا شده و بعضی از انها خاص و شخصی هستند. تا به حال تعداد بسیار کمی از واریانت های پیدا شده دلیلی برای ایجاد بیماری ها هستند. خوشبخانه دسترسی رو به افزایش اطلاعات توالی یابی از هزاران هزار فرد فرد سالم کمک می کند که لیست واریانت های نادر برای انهایی که مشکوک به پاتوژن هستند کمتر شود. اگرچه با پیشرفت های اخیر بعضی از واریانت ها نیاز به این دارند که به طور دقیق مورد بررسی قرار گیرند و علت و معلولی انها ثابت شود. این گونه واریانت ها به عنوان واریانت ها غیر مطمئن  (variant of uncertain significant)  طبقه بندی می شود و واریانت هایی که در ژن که به عنوان بیماری زا شناخته می شوند، درصد کمی از انها از طریق پانل های چند ژنی و بسیاری از انها توسط WGSیا WES مشخص می شود.

بنابراین طبقه بندی کردن هر یک از واریانت ها با توجه به پاتوژنتیسیتی آنها بسیار مهم می باشد زیرا مثب و منفی کاذب تاثیربسیار زیادی بر روی مراقبت بیمار دارد. بازنگری واریانت ها بایستی دارای :

1. گزارش های قبلی درباره بیماری که مرتبط با یک واریانت خاص

2. گسترش یافتگی واریانت ها همراه با بیماری درون خانواده

3. نادر بودن در جمعیت سالم

4. مستندات تجربی و پیش بینی محاسبه ای برای واریانت به وجود آورنده یک بیماری

به دلیل سلیقه ای بودن این فرآیند، مخالفت ها با توجه به طبقه بندی واریانت ها میان ارائه دهنگان تجاری، پایگاه های اطلاعاتی ملی و حتی مطالعات افراد مجرب در یک مرکز وجود دارد. این یافته در تلفیق با واریانت های تشخیصی در مورد سندرم ها، باعث مهم و اساسی شدن مشاوران ژنتیک در حوزه مراقبت های پزشکی خانواده هایی شده است که داراری یک بیماری ارثی هستند. تجربیات آنها در بازبینی واریانت ها و درمان چالش های فیزولوژیکی و زندگی کردن با تشخیص یک بیماری ژنتیکی مهم می باشد.

 

آینده استفاده از ngs در فعالیت های پزشکی

استفاده موفق از ژنومیکس بالینی نیازمند گسترش و اشتراک گذاری اطلاعات اساسی بالینی و ژنتیکی همراه با پیشرفت هایی در طبقه بندی دقیق بیماری ها می باشد. اینگونه پزشکی دقیق و غالبا شخصی با تلفیق ژنوم و اطلاعات بالینی، استفاده از توالی یابی عمیق و گسترده بیان ژن ها و تکنولوژی های پیشرفته میسر خواهد شد. بنابراین ژنوم انسان یک ابزار قدرتمند بالینی می باشد که در پزشکی مرتبط با بیماری های قلبی و عروقی استفاده شده است و پتانسیل کاربرد های آن در تشخیص و درمان هرچه دقیق تر برای افق های نزدیک طراحی شده است.

 

مقایسه توالی یابی نسل اول و توالی یابی نسل جدید (NGS)

در توالی یابی نسل اول، توالی های DNA مورد نظر در حضور نوکلئیک اسیدهای نشاندار شده فلئورسنت همانند سازی شده که باعث به وجود آمدن سایز های متفاوت با نوکلئیک اسیدهای خاص در انتهای آنها می شود. این نوکلئیک اسیده ای انتهایی باعث شناسایی کلی توالی شده و میتوان با توالی رفرنس ژنوم مقایسه کرد. در NGS، میلیون ها قطعه به طور همزمان توالی یابی شده و با جورچین کردن (assembling) و تطابق (alignment) آنها نسبت به ژنوم رفرنس ادامه می یابد. در اینجا هر یک از ژنوم ها دیپلوئید با رنگ های سیاه و نارنجی مشخص می شود. کادر بنفش رنگ نشان دهنده ی واریانت های هتروزیگوت، کادر مشکی نشان دهنده ی عدم پوشش توالی یابی و کادر قرمز رنگ نشان دهنده ی عدم توانایی این تکنیک در توالی یابی تکرار های ژنومی می باشد.

Parikh VN, Ashley EA. Next-Generation Sequencing in Cardiovascular Disease: Present Clinical Applications and the Horizon of Precision Medicine. Circulation. 2017 Jan 31;135(5):406–9.